农业生物技术学报

作者：戴世馨, 赵勤, 徐魁, 牟欣然, 杜森焱, 伍锐, 文翼平, 黄小波, 颜其贵, 曹三杰

单位：四川农业大学 动物医学院/猪病研究中心/国家级动物类实验教学示范中心/农业农村部兽用药物与兽医诊断技术四川科学观测站, 成都 611130

关键词：重组猪链球菌溶血素(rSly),猪肾细胞(PK-15),细胞毒性,细胞死亡方式,细胞凋亡,

基金：四川省“十四五”川猪重大科技专项(2021ZDZX0010); 中央引导地方科技发展专项(2021ZYD0086)

猪链球菌(Streptococcus suis)是一种危害严重的人畜共患病原菌,猪链球菌溶血素(suilysin, Sly)在猪链球菌的侵袭和致病中起关键作用,对多种类型的细胞具有毒性作用,但目前关于Sly的细胞毒性机制研究较少。为了探讨低浓度(0.3~0.6 μg/mL) Sly诱导猪肾细胞PK-15 (porcine kidney-15)的死亡方式,本研究首先采用原核表达并纯化获得重组猪链球菌溶血素(recombinant suilysin, rSly),通过乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)释放检测rSly对PK-15细胞的毒性作用,并针对4种常见程序性细胞死亡方式,利用qPCR、间接免疫荧光、Werstern blot和流式细胞术对rSly作用于PK-15细胞12及24 h诱导的细胞死亡方式进行验证。结果显示,成功表达具有较高溶血活性(溶血单位为214)的rSly毒素蛋白,确定其对PK-15细胞的毒性作用呈浓度依赖性,并且发现rSly作用PK-15细胞12和24 h均引起PK-15细胞凋亡相关基因—半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3 (cysteine aspartic acid specific protease 3, Caspase 3)、Caspase 9的转录水平显著升高(P<0.05),细胞凋亡率与rSly浓度呈正相关,0.6 μg/mL rSly作用PK-15细胞24 h,细胞凋亡率从9.35%增至49.9%;自噬关键基因—微管相关蛋白轻链3B (microtubule associated protein 1 light chain 3β, LC3β)基因转录水平无明显变化且无自噬小体形成;焦亡关键基因—胃泌素D (gasdermin D, GSDMD)的转录水平无明显变化且GSDMD蛋白未发生明显切割;坏死性凋亡相关基因下调,且磷酸化混合系列蛋白激酶样结构域蛋白(phosphorylated mixed lineage kinase domain-like protein, p-MLKL)表达水平受到抑制。上述结果提示低浓度rSly诱导PK-15细胞死亡的方式主要是凋亡。本研究丰富了Sly毒性作用的细胞模型,有助于揭示参加猪链球菌感染发展的分子机制。

来源：2024年第2期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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