农业生物技术学报

作者：金东升, 漏懿荣, 王瑶华, 段丽君, 李其昂, 陈琛, 闫茂仓, 陈炯, 周前进

单位：1 宁波大学 农产品质量安全危害因子与风险防控国家重点实验室,宁波 315211;2 宁波大学 海洋学院,宁波 315832;3 浙江省海洋水产养殖研究所 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室;温州 325005

关键词：重组酶聚合酶技术(RPA),急性肝胰腺坏死病(AHPND),pirA,pirB,检测,

基金：浙江省公益技术研究计划/农村农业(LGN22C010001); 浙江省重点研发项目(2021C02059); 国家自然科学基金(42276110); 宁波市科技特派员项目(2022S210); 浙江省“三农九方”农业科技协作计划项目(2023SNJF062); 浙江省近岸水域生物资源开发与保护重点实验室开放基金(J2022001); 宁波大学One health交叉学科研究项目(HZ202201); 温州市基础性科研项目(S2020020)

急性肝胰腺坏死病(acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是一种新近出现的对虾(Penaeidae)细菌性疾病,给世界范围内的对虾养殖业造成了巨大的经济损失。AHPND主要由携带毒力基因pirA和pirB的弧菌(Vibrio spp.)引起。本研究以pirA和pirB为检测靶标,分别设计和筛选特异性引物和探针,建立重组酶聚合酶扩增(recombinase polymerase amplification, RPA)方法。RPA反应在39 ℃下进行,反应时间设定为20 min。结果显示,针对pirA和pirB基因分别筛选到1套引物/探针组合。应用该引物/探针组合对RPA方法进行系列测试,发现引物/探针组合均能够特异性检出目标毒力基因,对溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(V. parahaemolyticus),以及虾肝肠孢虫(Enterocytozoon hepatopenaei)等13种微生物的基因组DNA未出现扩增。灵敏度实验结果发现,使用pirA的引物/探针组合最低能够稳定检测出0.01 fg/μL的重组质粒pirAB-pMD19,而使用pirB的引物/探针组合最低能够稳定检测出0.1 fg/μL的重组质粒pirAB-pMD19。经优化,检测pirA和pirB的RPA反应的最优引物浓度为0.4 µmol/L,探针浓度为0.16 µmol/L。使用优化的引物/探针组合对可疑南美白对虾(Penaeus vannamei)组织样品利用RPA方法进行检测,结果显示,利用建立的RPA方法能够准确地从对虾组织样品中检测到pirA和pirB,综合检测结果与世界动物卫生组织(World Organisation for Animal Health, WOAH)推荐的PCR方法结果一致。综上,本研究分别针对pirA和pirB建立的PRA方法能够快速、准确地检出ANPND病原,而且操作简便、耗时短,有望成为AHPND病害日常监测和快速检测的重要补充。

来源：2024年第4期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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