农业生物技术学报

作者：刘芯怡, 权冉, 刘昱成, 陈俊贞, 倪慧莹, 付强, 史慧君

单位：1 新疆农业大学 动物医学学院,乌鲁木齐 830052; 2 新疆草食动物新药研究与创制重点实验室,乌鲁木齐 830052; 3 省部共建绵羊遗传改良与健康养殖国家重点实验室/新疆农垦科学院畜牧兽医研究所,石河子 832000

关键词：牛病毒性腹泻病毒(BVDV),小干扰RNA (siRNA)技术,肿瘤坏死因子受体相关因子2 (TRAF2),Sushi、Nidogen和EGF样结构域1 (SNED1),

基金：国家自然科学基金(32060042; 32160829); 新疆维吾尔自治区青年科技拔尖人才专项(2022TSYCCX0049); 新疆维吾尔自治区杰出青年基金(2022D01E15); 新疆维吾尔自治区研究生科研创新项目(XJ2022G131); 新疆农业大学大学生创新项目(dxscx2022183)

牛病毒性腹泻/粘膜病(bovine viral diarrhea/mucosal disease, BVD/MD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus, BVDV)引起的接触性传染病,会导致持续性感染,感染犊牛(Bos taurus)会不断向外界排出病毒。本课题组前期使用RNA-蛋白质相互作用检测(RNA-protein interaction detection, RaPID)技术,筛选出了与BVDV互作的肿瘤坏死因子受体相关因子2 (tumor necrosis factor receptor associated factor 2, TRAF2)和Sushi、Nidogen和EGF样结构域1 (Sushi, Nidogen and EGF like domains 1, SNED1)基因。为了确定TRAF2和SNED1基因对BVDV复制的影响,本研究利用小干扰RNA (small interfering RNA, siRNA)技术敲低牛肾细胞(madin-darby bovine kidney cells, MDBK)中TRAF2和SNED1基因,通过qPCR检测TRAF2和SNED1基因的敲低效率和BVDV感染TRAF2和SNED1敲低细胞的BVDV 5'UTR RNA水平变化;使用免疫荧光染色法检测BVDV复制的中间产物双链RNA (double stranded RNA, dsRNA)的积累变化;通过荧光倒置显微镜观察致细胞病变效应(cytopathic effect, CPE),使用Karber法计算子代病毒滴度变化。结果表明,TRAF2和SNED1的mRNA水平显著性降低(P<0.05),表明成功构建了TRAF2以及SNED1敲低细胞(TRAF2 KD和SNED1 KD);BVDV感染对照组(NC) 36 h开始出现明显的空斑、脱落、死亡等CPE现象,TRAF2 KD细胞和SNED1 KD细胞的CPE现象减弱;与对照组(NC)相比,在BVDV感染TRAF2 KD和SNED1 KD细胞后,BVDV 5'UTR RNA水平在24、36和48 h显著下降(P<0.05);通过免疫荧光染色检测BVDV复制的中间产物dsRNA形成和累积,在TRAF2 KD和SNED1 KD细胞中36和48 h绿色荧光强度明显降低;BVDV感染TRAF2 KD和SNED1 KD细胞后48 h子代病毒滴度极显著降低(P<0.01)。以上结果表明,敲低TRAF2和SNED1会抑制BVDV复制,本研究为揭示BVDV致病机制提供重要依据。

来源：2024年第9期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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