农业生物技术学报

作者：徐佳微, 辛长卫, 李铁山, 赵格, 曲志娜, 赵建梅, 高玉斌, 张喜悦, 王君玮

单位：1 中国动物卫生与流行病学中心 致病微生物监测室,青岛 266032; 2 青岛大学附属医院 康复二科,青岛 266003; 3 博爱县职业中等专业学校,博爱 454450

关键词：单核细胞增生李斯特菌,微滴式数字PCR (ddPCR),iap基因,标准物质,

基金：国家重点研发计划(2022YFC2303900; 2022YFD1301003); 中国动物卫生与流行病学中心创新基金(DW2021001-13)

单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)是最严重的食源性病原菌之一。本研究以细胞壁水解酶基因(invasion associated protein, iap)为靶基因建立了微滴式数字PCR (droplet digital PCR, ddPCR)方法,优化了反应条件并测试了方法的特异性、灵敏度和重复性,并利用所建立的方法进行了临床样品的检测以及应用该方法研制其标准物质。结果显示,在10 μmol/L引物用量为1.5 μL、10 μmol/L探针用量为0.45 μL和退火温度在60 ℃时,ddPCR方法的扩增效果最好,最终成功建立了单增李斯特菌ddPCR检测方法。所建立的ddPCR检测方法具有较好的特异性,与其他非特异性菌株不发生交叉反应;重复性试验结果显示组间变异系数为1.57%~4.32%,证实该方法重复性好;该方法具有较高的灵敏度,最低检出下限为6.65 copies/μL。利用 ddPCR方法和qPCR方法检测实验室保存的47份临床阳性样本,符合度为100%;应用所建立的方法对标准物质进行均匀性和稳定性检验,并联合9家实验室对标准物质定值,定值结果为5.79×103 copies/μL,不确定度为0.47×103 copies/μL。本研究建立的ddPCR检测方法可用于实验室中单增李斯特菌的检测和标准物质的研制,可成为监测单增李斯特菌感染的一种技术手段。

来源：2024年第10期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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