农业生物技术学报

作者：陈秋崇, 李尚朴, 苗洱钰, 周冰倩, 王旭, 孟祥宇, 王小龙, 徐坤

单位：西北农林科技大学 动物科技学院/农业农村部动物生物育种国际联合研究中心/陕西省动物遗传育种与繁殖重点实验室,杨凌 712100

关键词：CPRISPR/Cas12i,同源重组,RS-1 (C20H16Br2N2O3S),组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi),绵羊,

基金：国家自然科学基金(32301251; 32272848); 现代农业产业体系(CARS-39-03); 陕西省地方助学金项目(2022GD-TSLD-46); 国家级大学生创新创业训练计划(202210712099)

CRISPR/Cas12i是我国学者新近开发的、具有自主知识产权的CRISPR基因编辑系统,被证实具有不亚于CRISPR/Cas9系统的打靶效率。同源定向修复(homology-directed repair, HDR)是DNA双链断裂(double-stranded break, DSB)的主要修复方式之一。基于HDR机制的基因编辑可用于纠正基因组中任何形式的突变,但受限于哺乳动物细胞中普遍较低的HDR效率。本研究首先通过单链复性(single-strand annealing, SSA)报告试验、剂量梯度和浓度梯度实验分别验证CRISPR/Cas12i系统在人(Homo sapiens)胚肾细胞系HEK293T中不同靶点的活性、介导HDR编辑的单链寡核苷酸(single-stranded oligonucleotides, ssODN)供体模板剂量及添加小分子药物的适宜浓度,进而通过流式细胞分选、基因组PCR、Sanger测序和在线预测等手段,检测添加不同小分子药物对HEK293T细胞和绵羊(Ovis aries)胎儿成纤维细胞中CRISPR/Cas12i系统介导的HDR编辑效率的影响。结果显示,CRISPR/Cas12i系统在HEK293T细胞18个不同靶点均表现出较高编辑活性,除2个位点稍低外,其余均在80%左右;不同剂量及长度的ssODN对HDR效率有一定影响,且小分子药物适宜浓度在不同物种和不同类型细胞中略有不同;组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitor, HDACi)和RS-1 (C20H16Br2N2O3S)对HEK293T细胞和绵羊胎儿成纤维细胞中CRISPR/Cas12i系统介导的HDR编辑效率均有显著提升,其中RS-1细胞毒性最小,且在提升HDR效率同时未显著降低插入/缺失突变(insertion/deletion mutation, InDel)效率;此外,Entinostat作为HDACi之一,在绵羊胎儿成纤维细胞的骨形态发生蛋白受体1B (bone morphogenetic protein receptor 1B, BMPR1B)基因相关位点提升HDR编辑效率约148倍。总之,CRISPR/Cas12i系统具有较高编辑活性,能够在模式细胞和绵羊原代细胞中介导有效的、以ssODN为供体的HDR精确编辑,且适宜浓度的HDACi和RS-1可以有效提高HDR编辑效率。本研究为CRISPR/Cas12i基因编辑系统的推广与应用提供了参考和借鉴。

来源：2024年第10期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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