农业生物技术学报

作者：夏钱, 龚威, 金晶, 张晨, 高晓敏, 陈晨, 周舒简, 胡菜, 张玉, 李碧春, 左其生

单位：扬州大学 动物科学与技术学院,扬州 225009

关键词：鸡,多克隆抗体,LncRNA,原始生殖细胞(PGCs),

基金：国家自然科学基金(32002158); 中国博士后科学基金(2020M681746); 扬州大学科学创新计划(X20210663; X20210648)

鸡(Gallus gallus)原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)在转基因动物制备和种质资源保护领域具有广泛应用前景,为了解析鸡PGCs形成的分子机制,本研究前期鉴定了1个调节鸡PGCs形成的关键长链非编码RNA-骨形成蛋白(long noncoding RNA-bone morphogenetic protein 4, LncBMP4),可编码小肽EPC5 (expression in primordial germ cells chromosome 5)。本研究通过在线预测软件初步分析EPC5小肽的化学结构并进行初步的亚细胞定位。通过化学合成法构建PET-EPC5-His-B2M原核融合表达载体并转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL2感受态细胞,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)诱导后大量表达和纯化EPC5抗原。利用纯化的抗原进行动物免疫并收集抗血清(G1480, G1481),通过ELISA检测抗血清效价。纯化抗体并通过Western blot进行鉴定。结果表明,EPC5主要定位于细胞内并具有RNA聚合酶亚基。成功构建PET-EPC5-His-B2M载体,且诱导表达后重组蛋白大小约为25 kD。ELISA检测发现G1480抗血清效价为1:5.12×105 (OD抗血清/OD免前血≥2.1),G1481抗血清效价为1:1.024×106 (OD抗血清/OD免前血≥2.1)。对G1480抗血清进行纯化,产生的EPC5多克隆抗体浓度为10 mg/mL,ELISA检测显示效价为9.8 ng/mL时(OD450>0.2)。Western blot检测结果显示制备的多克隆抗体可以特异性结合体内外表达的EPC5蛋白。本研究成功地制备EPC5多克隆抗体,为进一步研究EPC5在PGCs形成过程中的功能和机制提供了基础。

来源：2023年第3期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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