农业生物技术学报

作者：代玉立, 刘晓菲, 甘林, 兰成忠, 滕振勇, 杨秀娟

单位：1 福建省农业科学院 植物保护研究所/福建省作物有害生物监测与治理重点实验室/福建省作物有害生物绿色防控工程研究中心,福州 350013; 2 福建省种子总站,福州 350001

关键词：大斑凸脐蠕孢,实时荧光定量PCR,内参基因,扩增效率,表达稳定性,

基金：福建省属公益类科研院所专项(2020R1024003); 国家重点研发计划项目(2021YFC2600402); 福建省农业科学院 “5511”协同创新工程(XTCXGC2021011; XTCXGC2021017); 福建省农业科学院农作物重大有害生物灾变机制与绿色防控 科技创新团队(CXTD2021002-1)

由异宗配合的子囊菌大斑凸脐蠕孢(Exserohilum turcicum)引起的大斑病(northern leaf blight)是我 国玉米(Zea mays)和高粱(Sorghum bicolor)生产的重要真菌病害。为筛选适用于玉米大斑病菌实时荧光定量 PCR (quantitative real-time PCR; qRT-PCR)的内参基因,本研究以转录延伸因子 1α (elongation factor-1α, EF-1α)、新生多肽相关复合物 α 多肽(nascent-polypeptide-associated complex alpha polypeptide, NACA)、60S 核糖体蛋白 L2 (60S ribosomal protein L2, RPL2)、60S 核糖体蛋白 L37a (60S ribosomal protein L37a, RPL37A)、泛素结合酶 (ubiquitin-conjugating enzyme, UBC)、α 微管蛋白 (α-tubulin, TUBA)、肌动蛋白 (actin, ACT)和 β 微管蛋白 (β-tubulin, TUBB)为候选内参基因,以玉米大斑病菌4个不同菌株、3个不同发育阶段、体内侵染4个不同时期以及苯醚甲环唑胁迫 4 个不同时间的样品为实验材料,通过 qRT-PCR 技术测定玉米大斑病菌各候选内参基因在上述不同条件下的表达量,利用geNorm (v3.5)、NormFinder (v0.953)、 BestKeeper (v1.0)、Delta-CT 以及 RefFinder (http://blooge.cn/RefFinder/)等分析方法综合评价候选内参基因的表达稳定性。同时,分别以筛选的稳定性较好和较差的内参基因,分析玉米大斑病菌羊毛甾醇 14α去甲基化酶(lanosterol 14α-demethylase, CYP51)基因在苯醚甲环唑胁迫下的表达规律。结果表明,8 个候选内参基因的扩增效率范围为 90.3%~97.8% (r>0.99),熔解曲线峰图均为单一峰,符合 qRT-PCR 的扩增效率要求。TUBA 和 TUBB 适于做玉米大斑病菌不同菌株间基因表达分析的内参基因 ;RPL2 和 TUBA 是 不同发育阶段表达较稳定的内参基因;NACA 和 TUBA 是体内侵染不同时期较理想的内参基因;ACT 适于做苯醚甲环唑胁迫不同时间基因表达分析的内参基因。qRT-PCR 分析表明,在苯醚甲环唑胁迫下,玉米 大斑病菌 CYP51 基因的表达量随时间的推移显著增加,胁迫 24 h 时,表达量达到最大,胁迫 36 h 表达量显著下调(P<0.05)。以稳定性较好的 ACT 作为内参基因时,与未胁迫组相比,苯醚甲环唑胁迫可显著诱导玉米大斑病菌 CYP51 基因上调表达(P<0.05)。但是,以稳定性较差的 TUBB 作为内参基因时,得出了2个菌株的 CYP51 基因表达量相反的结果。本研究为玉米大斑病菌基因表达定量分析提供了有效的校正工具,确保基因定量分析的准确性,为进一步研究玉米大斑病菌抗药基因过表达提供了参考依据。

来源：2023年第4期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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