农业生物技术学报

作者：郝瑞杰, 张燕玲, 徐淑雨, 李敏, 张铭铭, 李星雨, 陈亚珍, 郭允, 昝林森

单位：1 信阳师范学院 生命科学学院,信阳 464000; 2 西北农林科技大学 动物科技学院,杨凌 712100

关键词：5'cDNA末端快速扩增(5'RACE)技术,特异性反转录,RACE片段大小,牛脂肪组织,Kruppel样因子4(KLF4)基因,

基金：国家自然科学基金(31802043); 河南省自然科学基金(162300410227); 河南省高校重点研究项目(17A230007); 信 阳师范学院青年科研基金项目(2018-QN-044); 国家级大学生科创项目(S201810477010); 信阳师范学院生科院特色骨干学 科培育项目

5' cDNA 末端快速扩增(5' rapid amplification of cDNA ends, 5' RACE)技术是基因转录表达调控研究的关键手段之一,其操作复杂,对样品要求较高。牛(Bos taurus)脂肪组织杂质含量高,单位体积 RNA 含量低,经常造成 5' cDNA 末端扩增的失败,影响脂肪沉积分子机制的研究。Kruppel 样因子 4 (Kruppel- like factor 4, KLF4）是调控牛脂肪沉积的关键基因,为了准确鉴定牛 KLF4 基因在脂肪组织中表达的转 录起始位点,揭示脂肪沉积关键基因的表达调控机理,以郏县红牛皮下脂肪组织为研究对象,对经典5' RACE 技术进行改进。首先采用特异性反转录引物,仅反转录总 RNA 中的特定 mRNA,以提高目标基因的反转效率,耐受更低浓度的 RNA;然后,调整反转录体系,简化加尾前 cDNA 纯化步骤,减少目标 cDNA 的损失,保证后续 RACE 扩增中的模板浓度;最后,采用适当靠近 mRNA 5'端的基因特异性引物(产生较短的 RACE 片段),降低 RACE 扩增中聚合酶延伸能力,模板二级结构等因素的干扰。通过上述改进措施,成功获得了 KLF4 基因的 RACE 片段。对该片段进行测序和比对分析后,发现郏县红牛 KLF4 基因 的转录起始位点与 NCBI 数据库中以胞嘧啶 C 作为起始核苷酸的 KLF4 基因(NM_001105385)不同,其向 5' 端延伸了 2 个碱基(GA),以鸟嘌呤作为起始核苷酸,该结果更符合转录起始位点通常为一个嘌呤(A 或 G)的特征。分析不同长度 RACE 片段对 PCR 扩增的影响,结果发现较短的 RACE 片段(<500 bp)可以顺利扩增成功 ;而对于大于 1 000 bp 的 RACE 片段,试剂盒法和优化法均没有获得有效片段。本研究通过优化 5' RACE 技术,成功鉴定了郏县红牛皮下脂肪 KLF4 基因的转录起始位点,该新位点证实了我国地方牛种的遗传特异性,为进一步研究该基因在脂肪沉积中的作用提供了参考。

来源：2023年第4期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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