农业生物技术学报

作者：沈兆基, 谢春嫡, 沙嘎那日·吉日木图, 郭肖蓉, 周荣, 李奎

单位：1 佛山科学技术学院,生命科学与工程学院/广东省动物分子设计与精准育种重点实验室,佛山 528225;2 中国农业科学院 北京畜牧兽医研 究所,北京 100193

关键词：猪,非洲猪瘟病毒,蛋白结构,真核表达载体,

基金：中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(Y2021XK20); 国家自然科学基金(31972541); 六安市产学研合作重 大专项

非洲猪瘟(African swine fever, ASF)是一种对猪(Sus scrofa)具有毁灭性的疾病,通常引发出血热, 对养猪业危害巨大。多基因家族(multigene families, MGF) 505-5R 位于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)基因组右侧可变区域(the right variable region, RVR),能够影响病毒的毒力。本研究旨在分析 MGF505-5R 基因和蛋白的分子特征,构建MGF505-5R基因真核表达载体。根据ASFV参考基因组(GenBank No. MK128995.1)提取 MGF505-5R 基因序列进行生物信息学分析, 并合成 MGF505-5R 基因片段。通过同源重组的方式将 MGF505-5R 基因连接至 pRK5M-C-2×Strep 载体。经 PCR 和测序鉴定后, 将重组质粒 pRK5M-C-2×Strep-MGF505-5R 转染至猪小肠上皮细胞系(porcine intestinal columnar epithelial cells, IPEC-J2)中, 通过免疫荧光和 Western blot 检测 MGF505-5R 的基因表达效果。通过 qPCR 检测过表达 pRK5M-C-2×Strep-MGF505-5R 的 IPEC-J2 细胞中外切体(exosome)8个亚基、Mtr4 外切体 RNA 解旋酶(Mtr4 exosome RNA helicase, MTREX)、末端核苷酸转移酶 4A (terminal nucleotidyltransferase 4A, TENT4A)、锌指 DHHC 型棕榈酰转移酶 16 (zinc finger DHHC-type palmitoyltransferase 16, ZDHHC16)基因的表达。生物信息学分析结果表明,MGF505-5R 基因在系统发育树中分为3个分支,MGF505-5R 蛋白在20、105 和 485 位氨基酸存在正向选择。MGF505-5R 蛋白的二级结构与三级结构相符, 正选择位点均位于无规则卷曲上。PCR 结果显示 MGF505-5R 基因片段成功连接至 pRK5M-C-2×Strep 载体中。免疫荧光和Western blot 检测结果显示, MGF505-5R 蛋白能够在猪 IPEC-J2 细胞中表达。qPCR 结果显示, 过表达pRK5M-C-2×Strep-MGF505-5R 的 IPEC-J2 细胞中外切体组分(exosome component, EXOSC) 1、EXOSC2、EXOSC3、EXOSC4、EXOSC5、EXOSC7、EXOSC8、EXOSC10、TENT4A 和 ZDHHC16 的表达量极显著降低(P<0.01);MTREX 的表达量无显著变化。本研究对 MGF505-5R 分子特征的分析,为该基因的进化研究提供基础; 构建 MGF505-5R 在猪 IPEC-J2 细胞的表达载体, 为 ASFV 与宿主之间的蛋白质相互作用研究提供有效的工具和实验素材。

来源：2023年第5期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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