农业生物技术学报

作者：王媛媛, 叶丽君, 朱妍妍, 陈玉欣, 尚菲菲, 李亭亭, 王海涛, 刘秋月

单位：1 蚌埠医学院生命科学学院,蚌埠 233030;2 中国科学院 遗传与发育生物学研究所,种子创新研究院,北京 100101

关键词：CRISPR/Cas9,先导编辑(PE),干扰素调节因子 3 (IRF3),布鲁氏杆菌,绵羊,

基金：中国科学院战略性先导科技专项(A 类)(XDA24030205); 国家大学生创新创业训练计划项目(202110367057)

布鲁氏菌病(Bruollosis)是对羊养殖业危害最严重的传染病之一,在山羊(Capra hircus)中,干扰素调节因子 3 (interferon regulatory factor 3, IRF3)基因调控区的突变对抵抗布鲁氏杆菌(Brucella)的感染起到一定抑制作用。绵羊与山羊的IRF3 基因高度同源,可通过基因编辑技术在绵羊(Ovis aries)中引入相同类型的IRF3 突变,获得 IRF3 基因编辑的绵羊单克隆细胞株,并为后续利用体细胞核移植技术制备具有抗布鲁氏菌病的基因修饰绵羊提供供体细胞。本研究利用CRISPR/Cas9 及先导编辑(prime editing, PE)技术对绵羊 IRF3 基因的上游开放阅读框(upstream open reading frame, uORF)进行编辑。首先根据 NCBI 数据库绵羊的IRF3 参考序列设计引物,经过IRF3 克隆和测序获得湖羊的IRF3 序列 ;在此基础上设计靶向的小向导 RNA (small guide RNA, sgRNA)及先导编辑向导 RNA (primer editing sgRNA, pegRNA)序列,并将其构建到表达载体上,结合 CRISPR/Cas9 或 PE 表达载体转染湖羊胎儿成纤维细胞株,经单克隆细胞筛选,成功利用CRISPR/Cas9 获得 2 株 IRF3-uORF 靶点位置精准缺失 10 bp的阳性单克隆细胞株。而利用PE 技术未获得 IRF3-uORF 精确编辑的单克隆细胞株。本研究为结合体细胞克隆技术在个体水平上获得抗布鲁氏菌病绵羊育种新材料和探究与 IRF3 相关抗病的机制提供新思路。

来源：2023年第8期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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