农业生物技术学报

作者：徐磊, 赵育蓉, 胡悦旻, 王昊, 彭玥晗, 鞠辉明

单位：1 扬州大学 兽医学院 ,扬州 225009; 2 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心 ,扬州 225009; 3 扬州大学 广陵学院 ,扬州 225009

关键词：CRIPSR/Cas9,多基因敲除,载体构建,

基金：江苏省自然科学基金(BK20201224); 国家自然科学基金(31872323); 江苏高校优势学科建设工程资助项目 (2018); 江苏高校品牌专业建设工程资助项目(TAAP,2018-2022); 扬州大学大学生创新创业训练计划项目(X20200705)

CRISPR/Cas9 系统是近年来快速发展的一种简单高效的基因编辑系统。在哺乳动物中，同时靶 向敲除多基因的研究仍然较为匮乏。为优化哺乳动物中靶向多基因的敲除系统的构建，本研究在已有的 CRISPR/Cas9 载 体 的 基 础 上 进 行 升 级 改 造 ，将 4 个 U6 启 动 子 介 导 的 小 向 导 RNA (small guide RNA, sgRNA)表达框串联至一个载体中的形式制备了多基因位点编辑载体，分别选取家猪(Susscrofa)的去乙酰化 酶 3 基 因 (sirtuin 3, Sirt3) 和 围 脂 滴 蛋 白 1 基 因 (perilipin 1, Plin1) 的 2 个 sgRNA，构 建 了 2 个 猪 Sirt3 sgRNA 的基因编辑载体(S2)、2 个猪 Plin1 sgRNA 基因编辑载体(P2)和同时包括上述 4 个 sgRNA 的基因编 辑载体(S2P2)，上述载体分别转染猪肾细胞 PK15，以转染未装载靶点质粒的细胞为对照组(CON 组)，在各实验组细胞目的基因的 DNA 水平、RNA 水平和蛋白水平检测目的基因敲除效率。结果表明，各实验组 细胞目的基因 DNA 中均检测出突变，S2P2 组和 S2 组中 Sirt3 基因突变率分别为 33% 和 26%，S2P2 组和 P2 组中 Plin1 基因突变率分别为 33% 和 24%；对目的基因 RNA 水平与蛋白水平的检测结果表明，与 CON 组 相比，所有实验组的目标基因 mRNA 及蛋白表达量均有所下降，差异极显著(P＜0.01)，其中 S2 组与 S2P2 组间 Sirt3 基因表达量差异不显著；P2 组与 S2P2 组间 Plin1 基因表达量差异不显著。本研究通过改良的 CRISPR/Cas9 载体系统构建了可以同时对猪 Sirt3 基因和 Plin1 基因高效编辑的载体，有助于后续开展多基因功能的研究。

来源：2022年第5期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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