农业生物技术学报

作者：宋林锦, 许厚强, 李永, 孙金魁

单位：1 贵州大学 高原山地动物遗传育种与繁殖教育部重点实验室/贵州省动物遗传育种与繁殖重点实验室,贵阳 550025; 2 贵州大学 动物科学 学院,贵阳 550025; 3 贵州大学 生命科学学院,贵阳 550025

关键词：关岭牛,胰岛素样生长因子 1 (IGF1),RNA 干扰,成肌细胞,细胞增殖,

基金：国家自然科学基金(31571279)

胰岛素样生长因子 1 (insulin like growth factor 1, IGF1)是通过调控骨骼肌蛋白的合成影响肌肉 发育的单链多肽类激素,对细胞增殖等多种生理功能具有重要作用,本研究旨在探究IGF1基因对关岭牛 (Bos taurus)成肌细胞的影响。选用健康的成年(2~3 岁)关岭牛 3 头,采集心、肝、脾、肺、肾、前腿肌、后腿 肌、背最长肌、斜方肌、臀肌、胃、小肠12个组织样提取RNA,采集背最长肌组织成功培养关岭牛成肌细胞。运用 qPCR 技术检测 IGF1 基因在不同组织中的相对表达量;运用在线软件对关岭牛 IGF1 蛋白质理化性质、二级结构和三级结构、亚细胞定位进行分析 ;同时通过在线软件设计 IGF1 基因的 3 对短发夹RNA (short hairpin RNA, shRNA)干扰序列和 1 对阴性对照序列,与 pGPU6-GFP-Neo 载体连接后进行测 序,将构建成功的 IGF1基因干扰载体转染至成肌细胞;运用qPCR技术检测并筛选出干扰效率最高的干 扰载体,分析该干扰载体对 IGF1 基因表达的影响;运用 qPCR 技术检测干扰 IGF1 基因对细胞增殖相关基 因细胞周期蛋白 D1 (cyclin D1)和细胞周期蛋白依赖性激酶 2 (cyclin-dependent kinases 2, CDK2)的相对表达量影响;运用 CCK8 (Cell Counting Kit-8)法检测成肌细胞增殖情况。结果表明,IGF1 基因在关岭牛心、前腿肌、后腿肌、背最长肌、斜方肌、臀肌等12个组织样中均有表达,在肝中相对表达量最高,极显著高于 其他组织(P<0.01);在培养关岭牛成肌细胞的基础上 ,成功构建关岭牛IGF1基因干扰载体 ,并筛选出 shRNA-IGF1-1 干 扰 效 率 最 高 (P<0.01);IGF1 蛋 白 的 分 子 式 为 C744H1186N214O216S15,相 对 分 子 质 量 为 17.06581 kD,理论等电点为 9.36,属碱性不稳定蛋白;IGF1 基因被抑制后,细胞增殖相关基因 cyclin D1 和 CDK2 的表达量均极显著低于 shRNA-NC (P<0.01)。CCK8 法检测细胞增殖结果表明,IGF1 基因被抑制后,在 24 和 72 h 成肌细胞增殖均显著低于对照组(P<0.05),48 h 为极显著水平(P<0.01),表明体外沉默 IGF1 基因后,会影响成肌细胞增殖能力和抑制成肌细胞增殖相关基因表达。本研究为进一步研究 IGF1 基因对关岭牛肌肉生长发育的作用及调控机制提供了基础数据。

来源：2022年第5期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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