农业生物技术学报

作者：李志明, 袁梦仪, 许海涛, 蔡德霖, 王相国, 肖龙菲, 安红, 王颖秋, 王骞, 郭勇, 齐晓龙, 倪和民

单位：1 北京农学院 动物科学技术学院,北京 102206;2 北京市昌平区动物疫病预防控制中心,北京 102299;3 全国畜牧总站,北京 100125

关键词：奶牛,妊娠相关糖蛋白6 (PAG6),原核表达,多克隆抗体,

基金：北京金桥种子工程项目(ZZ19002); 北京市奶牛产业创新团队项目(BAIC05-2017)

基于抗原抗体反应检测奶牛(Bos taurus)血液中妊娠相关糖蛋白(pregnancy-associated glycoproteins, PAGs)是目前世界上应用最普遍的牛早孕检测技术,以boPAG6作为标志物应用于母牛早期妊娠诊断的准确性更高,因此制备高敏感性的boPAG6多克隆抗体,能为奶牛早期妊娠诊断试剂盒的研发提供支持。本研究利用PCR技术扩增荷斯坦奶牛boPAG6 (GenBank No. NM_176617.2)基因,构建重组质粒pET30a-boPAG6;在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中表达His-boPAG6蛋白并优化,以重组蛋白His-boPAG6作为免疫原免疫BALB/c小鼠(Mus musculus)制备多克隆抗体,用ELISA方法检测血清效价,Western blot方法检测纯化后的抗体分别与重组蛋白His-boPAG6和奶牛血清的特异性反应,利用免疫荧光技术定位boPAG6在原代滋养层细胞中的表达。结果显示,本研究成功构建出大小为6 534 bp的重组质粒pET30a-boPAG6,并在异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)终浓度为0.5 mmol/L、诱导时间为8 h的条件下表达的His-boPAG6量最高,其蛋白分子质量为50 kD。以纯化后浓度为0.412 mg/mL的His-boPAG6蛋白免疫,ELISA中抗血清的效价为1∶102 400,多克隆抗体能特异性识别His-boPAG6抗原并有效区分妊娠和未妊娠奶牛血清,还可检测到原代滋养层细胞中存在boPAG6蛋白。本研究成功制备了boPAG6多克隆抗体,为奶牛早期妊娠ELISA检测系统的开发提供了理论支持。

来源：2022年第8期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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