农业生物技术学报

作者：张靖鹏, 江锦秀, 林裕胜, 游伟, 刘道泉, 毛坤明, 江斌, 胡奇林

单位：1 福建省农业科学院 畜牧兽医研究所,福州 350013; 2 福州市动物疫病预防控制中心,福州 350026; 3 福清市畜牧兽医中心,福清 350300

关键词：山羊地方性鼻内肿瘤病毒(ENTV-2),高分辨率熔解曲线(HRM),检测方法,

基金：福建省科技重大专项—农业重大疫病防控技术(2019NZ09007); 福建省科技计划项目—省属公益类科研院所重点项目(2018R1023-1); 畜病防控科技创新团队项目(CXTD2021007-2); “5511”协同创新项目(XTCXGC2021008)

对于山羊(Capra hircus)地方性鼻内肿瘤病毒(Enzootic nasal tumor virus 2, ENTV-2)引起的羊地方性鼻内肿瘤(enzootic nasal tumor, ENT),目前已建立了RT-PCR结合限制性内切酶鉴定ENTV的方法以及RT-PCR和qPCR等检测方法,但是内源性逆转录病毒(endogenous retrovirus, ERVs)的存在可干扰结果的准确性。本研究通过生物信息学方法将ENTV-2与ERVs和绵羊肺腺瘤病毒(Jaagsiekte sheep retrovirus, JSRV)进行比对,寻找ENTV-2囊膜蛋白(envelope protein, env)基因的保守序列并设计1对特异性引物,通过优化反应条件而建立高分辨率熔解曲线(high resolution melting curve, HRM)检测方法。优化结果显示,最佳反应体系为：上下游引物各0.4 μmol/L,模板1 μL,styo9 (2.5 μmol/L) 1 μL,2×Premix Taq 10 μL,补充ddH2O至终体积20 μL;反应条件为：94 ℃ 2 min;94 ℃ 15 s,59 ℃ 15 s,72 ℃ 15 s,40个循环;之后进行熔解曲线分析。构建env基因重组阳性质粒作为标准品,对HRM方法的特异性、敏感性和重复性进行检测。结果显示,所建立的HRM方法的特异性强,与ENTV-2高度同源的ERVs无交叉反应;敏感性高,对env基因重组阳性质粒的最低检测限为82.7拷贝/μL;重复性好,批内和批间重复性试验的变异系数均<1%。对92份临床样品的阳性检出率为18.7%,与TaqMan检测方法的符合率为100%。本研究可为山羊地方性鼻内肿瘤病毒病的早期、快速检测提供技术支持。

来源：2022年第12期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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