农业生物技术学报

作者：李占鸿, 宋子昂, 杨振兴, 李卓然, 廖德芳, 李华春, 杨恒

单位：1 云南省畜牧兽医科学院 云南省热带亚热带动物病毒重点实验室,昆明 650224; 2 云南农业大学 动物医学院,昆明 650201

关键词：蓝舌病病毒(BTV),VP6蛋白,原核表达,细胞系,

基金：国家自然科学基金(31760744); 国家重点研发计划(2016YFD0500908); 云南省中青年学术和技术带头人后备人才培养项目(2017HB055)

蓝舌病病毒(Bluetongue virus, BTV)的VP6蛋白(viral structural protein 6)在病毒复制与基因组组装中发挥着重要作用,构建稳定表达BTV VP6蛋白的细胞系,可为VP6蛋白功能研究及基因工程疫苗研制提供基础资料。本研究通过RT-PCR扩增BTV的VP6基因,分别构建出表达VP6蛋白的原核表达质粒pET32-BTV-VP6与真核表达质粒pCDH-BTV-VP6。将pET32-BTV-VP6转入大肠杆菌(Escherichia coli),在16 ℃进行诱导培养,VP6重组蛋白部分以可溶形式表达,表达量约为总菌体蛋白的24.5%。采用镍离子亲和层析对表达的VP6重组蛋白进行纯化并免疫新西兰兔(Oryctolagus cuniculu),制备抗VP6蛋白的多克隆抗体,抗体效价可达1∶12 000;Western blot与免疫荧光染色证实,制备的多克隆抗体可与BTV感染细胞产生的VP6蛋白发生特异性结合。将真核表达质粒pCDH-BTV-VP6转染BHK-21细胞,使用嘌呤霉素对转染后的细胞进行连续筛选,构建稳定表达BTV VP6蛋白的细胞系BHK-BTV-VP6;以兔抗VP6多克隆抗体为一抗,进行Western blot与免疫荧光检测,证实VP6蛋白在细胞中稳定表达。本研究实现了BTV VP6重组蛋白在大肠杆菌中的成功表达与纯化,构建了稳定表达BTV VP6蛋白的细胞系,为BTV VP6蛋白功能研究以及新型基因工程疫苗研发提供物质基础。

来源：2021年第4期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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