农业生物技术学报

作者：张宁, 秦怀远, 辛京京, 赵金山, 包汉勋, 李和刚

单位：1 青岛农业大学 动物科技学院,青岛 266109;2 胶州市农业农村局,青岛 266300

关键词：CRISPR/Cas9,双切刻系统,双荧光素酶检测,突变体,原间隔序列临近基序(PAM),

基金：国家自然科学基金(31572383; 31301936); 青岛市民生科技计划(19-6-1-68-nsh; 19-6-1-63-nsh); 山东省草学一流学科建设资助项目(2019-08)

通常使用的CRISPR/Cas9系统仅能识别靶标序列为NGG的原间隔序列临近基序(protospacer adjacent motif, PAM),而进化的xCas9、SpCas9-NG系统可识别序列为NG的PAM,扩大了靶标的识别范围,但脱靶效应却一直阻碍CRISPR/Cas9系统的发展,而双切刻系统会增加DNA的靶向特异性。为了提高PAM为NG的CRISPR/Cas9系统基因编辑的特异性,本研究设计并构建xCas9-D10A、SpCas9-NG-D10A、xCas9-H840A、SpCas9-NG-H840A四个切刻突变体以及相应的单链向导RNA (single guide RNA, sgRNA)表达载体,与双荧光素酶报告基因载体SSA-DKK2、SSA-DKK1构成特定的组合,共转染绵羊(Ovis aries)成纤维细胞,通过双荧光素酶活性检测的方式来验证DNA切割效率。结果表明,SpCas9-NG-D10A、SpCas9-NG-H840A突变体针对多数靶标载体其报告基因活性显著大于对照组(P<0.05),xCas9-H840A突变体完全没有活性,而xCas9-D10A仅在DKK1基因中表现出切割活性。相对而言,SpCas9-NG-D10A突变体活性稳定,切割DNA单链效率较高,故此载体可用于进一步的研究应用。本研究结果对于PAM为NG的CRISPR/Cas9双切刻系统的进一步研究及应用提供了重要的参考数据。

来源：2021年第6期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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