农业生物技术学报

作者：鹿鹏鹏, 吴伟怀, 郑金龙, 王桂花, 贺春萍, 林培群, 黄兴, 梁艳琼, 易克贤

单位：1海南大学 植物保护学院,海口 570228; 2中国热带农业科学院 环境与植物保护研究所/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室,海口 571101

关键词：剑麻,植原体,单管巢式PCR,正交试验,

基金：2019年海南省基础与应用基础研究计划(自然科学领域)高层次人才项目(2019RC282);国家重点研发项目(2018YFD0201100);财政部和农业农村部：国家麻类产业技术体系剑麻生理与栽培岗位(CARS-16-E16);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1630042019028;1630042020015)

剑麻紫色卷叶病是近年来剑麻(Agave sisalana)上发生的一种毁灭性病害。本课题组前期研究表明,该病与植原体高度相关。建立一种高效的分子检测技术对于植原体的深入研究及病害监测与检测非常必要。本研究拟建立剑麻紫色卷叶病相关植原体的高效单管巢式PCR检测技术。首先对单管巢式PCR反应体系的内外引物退火温度进行单因素试验;确定退火温度后,利用正交设计的方法对单管巢式PCR反应体系的内外引物浓度、dNTPs浓度和Ex Taq酶用量等关键因素进行优化。结果显示,当外引物Sis-F1/R1退火温度为64 ℃、内引物Sis-F2/R2退火温度为54 ℃,通过正交设计试验最终筛选出的最佳反应体系(25 μL)为：10×Ex Taq Buffer 2.5 μL,2.5 mmol/L dNTPs 5 μL,Ex Taq DNA Polymerase 1 μL,15 μmol/L的内引物Sis-F2/R2各 1 μL,0.02 μmol/L的外引物Sis-F1/R1各1 μL,模板 DNA 1 μL,ddH2O 11.5 μL。上述反应体系只对紫色卷叶病植株DNA模板扩增出条带,具有高度特异性;最低检测限为植原体质粒浓度≥1 fg/μL。本研究所建立的剑麻紫色卷叶病相关植原体单管巢式PCR检测体系为后续病害监测、相关性调查、致病性以及功能验证等方面的研究提供技术支持。

来源：2021年第7期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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