农业生物技术学报

作者：王凌, 谭训刚, 吴志昊, 王丽娟, 尤锋

单位：1 中国科学院 海洋研究所/海洋大科学中心/实验海洋生物学重点实验室,青岛 266071;2 青岛海洋科学与技术国家实验室/实验海洋生物学与生物技术实验室,青岛 266237;3 中国科学院大学,北京 100049

关键词：CRISPR/Cas9,牙鲆,基因编辑,

基金：国家重点研发计划(2018YFD0900202; 2018YFD0901202); 国家自然科学基金(31772834; 31672636)

CRISPR/Cas9是对靶向基因进行特定DNA修饰的基因编辑技术。基于其设计简单、成本较低和效率较高等优点,在哺乳动物中已被广泛应用于基因功能研究。在鱼类中,CRISPR/Cas9技术多用于模式鱼及淡水鱼类中基因的敲除,从而对基因的功能进行研究,而在海水鱼类特别是鲆鲽鱼类中相关研究还较少。牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我国重要的海水养殖鱼类,具有较高的经济价值。本研究首先在低浓度条件下(Cas9 message RNA (mRNA)和向导RNA (guide RNA, gRNA)浓度分别为250和100 ng/μL)对牙鲆肌肉发育相关基因肌分化因子(myogenic differentiation, myod)和性腺分化与发育相关基因接头相关蛋白复合物3 (adaptor-related protein complex 3, ap3)、脊椎蛋白1 (R-spondin 1, rspo1)及轴丝动力蛋白轻中链1 (dynein axonemal light intermediate chain 1, dnali1)(dnali1-part A和dnali1-part B)基因进行编辑,其中,dnali1-part A和dnali1-part B各设计2个gRNA位点,其余基因均设计1个。结果显示,rspo1、myod及dnali1-part A编辑实验鱼苗中均未检测到突变体,ap3基因突变率小于14.3%,而dnali1-part B突变率约为42.9%~45%。提高注射浓度至Cas9 mRNA 1 500 ng/μL和gRNA 1 000 ng/μL后,dnali1-part B突变率提高至65%。同时,单个个体检测的突变率也由10%~20%提升至80%~90%。进一步用高浓度条件对牙鲆原始生殖细胞(primordial germ cells, PGCs)标志基因dead end (dnd)、两性mab-3转录因子1 (doublesex and mab-3 related transcription factor 1, dmrt1)和17β羟类固醇脱氢酶1 (hydroxysteroid (17-beta) dehydrogenase 1, 17β-Hsd1)基因(2个gRNA)进行编辑,初孵仔鱼检测的各基因突变效率均为60%~80%。研究结果表明,低浓度条件下1个gRNA位点的基因编辑效率较低,仅为14.3%~45%,而高浓度下2个gRNA位点的基因编辑效率明显提高,可达60%~80%。本研究初步建立了牙鲆CRISPR/Cas9基因编辑方法,并为其在鲆鲽鱼类中的应用提供参考。

来源：2021年第9期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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