农业生物技术学报

作者：王幸, 李楠, 霍珊珊, 张建楼, 张辉, 仲飞

单位：1 吉林农业大学 动物科学技术学院,长春 130118; 2 河北农业大学 动物医学院/动物科学技术学院,保定 071001; 3 河北兽医生物技术工程技术研究中心,保定 071001

关键词：犬细小病毒,非结构蛋白1 (NS1),真核分泌表达,最适表达条件,人胚胎肾293T细胞 (HEK 293T),

基金：十三五国家重点研发项目(2016YFD0501002); 河北省高等学校科学技术研究项目(QN2016189)

犬细小病毒(Canine parvovirus, CPV)非结构蛋白1 (nonstructural protein 1, NS1)是CPV的重要功能蛋白,参与病毒的复制和转录,同时也是宿主细胞的毒性蛋白。为探索其生物学功能,需要制备重组NS1蛋白。本研究采用人(Homo sapiens) CD5信号肽序列介导NS1蛋白在真核细胞中进行分泌表达,以制备高纯度的NS1重组蛋白。首先,根据人CD5信号肽序列(GenBank No. NM_014207.4),设计合成1对两端带有限制性内切酶位点的互补全长CD5信号肽序列(2条寡核苷酸链);然后将2个寡核苷酸链进行退火处理,生成CD5信号肽基因,进而通过酶切位点插入真核表达载体pcDNA3.1-NS1/H的NS1基因5'端,与NS1基因融合,构建形成与His标签融合的NS1分泌型真核表达载体pcDNA3.1-CD5-NS1/H。将该表达载体转染人胚胎肾(human embryonic kidney, HEK) 293T细胞使其表达,用Ni-NTA琼脂糖胶粒通过亲和层析法从细胞培养基中纯化重组NS1蛋白。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,纯化的NS1蛋白纯度达95%以上,并能与抗His标签抗体进行特异结合,表明所构建的表达载体可以介导NS1在真核细胞中进行分泌型表达。为提高表达水平,进一步分析载体用量、转染时间和表达时间对NS1表达的影响,初步确定NS1表达的最适条件为在T75细胞培养瓶中载体用量30 μg、转染时间5 h、表达时间48 h。本研究可为进一步探讨NS1的生物学功能提供基础资料。

来源：2020年第1期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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