农业生物技术学报

作者：王梦珂, 郭玉堃, 郭婉莹, 贾宾, 张菡, 郭豫杰, 王江, 杨国宇, 韩莹倩

单位：河南农业大学 牧医工程学院/农业部动物生化与营养重点实验室,郑州 450002

关键词：小泛素样修饰蛋白(SUMOs),泛素样特异蛋白酶1 (Ulp1),重组截断型Ulp1,SpyTag/SpyCatcher,环化结构,稳定性,

基金：国家重点研发项目 (2017YFD0501100)

SpyTag/SpyCatcher环化技术是一种自发迅速的共价连接反应,通过环化蛋白的骨架以实现目标蛋白的环化,从而提高目标蛋白稳定性。研究显示,SpyTag/SpyCatcher技术介导的环化过程不受环境的影响,不会影响目标蛋白原本的催化活性和功能,且一旦完成便具有极强的稳定性。小泛素样修饰蛋白(small ubiquitin-like modifiers, SUMOs)是一种十分有效的促溶标签,广泛应用于重组蛋白的原核表达过程中。泛素样特异蛋白酶1 (ubiquitin-like-specific protease 1, Ulp1)是SUMO特异性蛋白酶中的一个重要成员,具有将SUMO从目标融合蛋白上切下,不残留任何氨基酸碱基的特异性酶切活性,且参与SUMO的成熟过程,但较差的稳定性限制了其应用。本研究使用截断型Ulp1 (Gly304~Lys621)代替全长Ulp1,并对其序列进行了优化,得到了重组截断型Ulp1。重组截断型Ulp1既具有Ulp1全部的酶活性,又能更好地在大肠杆菌(Escherichia coli)中高效表达。本研究设计并表达了重组截断型(recombinant truncated Ulp1-His6, rtUlp1)、SpyTag-rtUlp1-SpyCatcher-His6 (crtUlp1)和Spy-TagΔDA-rtUlp1-SpyCatcherΔEQ-His6 (lrtUlp1)三种蛋白酶。综合比较3种蛋白酶的最适反应条件以及热稳定性,结果显示,crtUlp1的最佳反应酶切温度比lrtUlp1高10 ℃,比rtUlp1高5 ℃。crtUlp1在40 ℃条件下孵育2 h后仍保留87.3%的相对酶活,lrtUlp1在40 ℃条件下孵育2 h后仍保留43.69%的相对酶活,而rtUlp1几乎丧失了全部的酶活。且crtUlp1在广泛的酸碱范围内都能保持较高的酶活,而rtUlp1与lrtUlp1只在其最佳反应pH下表现出较高的酶切活性。本研究利用SpyTag/SpyCatcher技术获得了高稳定性的rtUlp1,评价了环化结构对rtUlp1热稳定性的影响以及SpyTag/SpyCatcher技术对rtUlp1热稳定性提高的效果,为获得具有高热稳定性的SUMOs特异性蛋白酶及促溶标签SUMOs的广泛使用提供技术基础。

来源：2020年第2期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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