农业生物技术学报

作者：周静, 金晶, 何娜娜, 张晨, 王曼, 左其生, 张亚妮, 李碧春

单位：扬州大学 动物科学与技术学院/江苏省动物遗传繁育与分子设计重点实验室/农业科技发展研究院/教育部农业与农产品安全国际合作联合实验室,扬州 225009

关键词：无翅型MMTV 整合位点家族成员5A (Wnt5a),shRNA,慢病毒载体,鸡胚胎干细胞,

基金：国家重点研究发展计划(2017YFE0108000); 国家自然科学基金(31772582; 31872341); 江苏高校优势学科建设工程项目; 扬州大学高层次人才支持计划项目(X20170702); 江苏省高等学校大学生创新创业训练计划项目(201811117013Z)

本课题组前期通过高通量测序发现无翅型MMTV整合位点家族成员5A (winglesstype MMTV integration site family member 5A, Wnt5a)介导的Wnt/β-catenin信号在鸡(Gallus gallus)雄性生殖细胞形成过程中被显著富集,为研究Wnt5a基因介导的Wnt/β-catenin信号通路在鸡胚胎干细胞(embryonic stem cells, ESCs)向雄性生殖细胞分化过程中的功能,本研究通过慢病毒(Lentivirus)介导的RNA干扰技术,建立稳定干扰Wnt5a基因的鸡胚胎干细胞系。针对Wnt5a基因设计3个干扰靶点序列和1个阴性对照序列,与pGMLV-SC5慢病毒载体重组;将慢病毒重组载体分别转染鸡DF-1细胞,通过qRT-PCR检测Wnt5a基因的表达,以确定各干扰载体的干扰效率,并对干扰效果最好的重组载体进行慢病毒包裹。利用包裹干扰载体的慢病毒感染鸡ESCs,采用qRT-PCR及Western blot检测不同组别Wnt5a及Wnt信号通路下游关键基因轴抑制蛋白2(axis inhibition protein 2, Axin2)、β-链蛋白(beta catenin,β-catenin),磷酯酶 C (phospholipase C, PLC)及泛素特异性肽酶54基因(ubiquitin specific peptidase 54, USP54)的表达量变化。同时构建Wnt5a过表达载体(pCDNA3.0-Wnt5a)进行Wnt5a基因的拯救实验。成功构建3条靶向Wnt5a的慢病毒干扰表达载体,分别为Wnt5a-shRNA1、Wnt5a-shRNA2和Wnt5a-shRNA3,Wnt5a-shRNA2重组质粒对Wnt5a基因的抑制效果最为明显,干扰效率可达80%,将Wnt5a-shRNA2重组质粒包裹慢病毒,病毒滴度：5×108 TU/mL;将Wnt5a-shRNA2慢病毒转染鸡ESCs后,qRT-PCR和Western blot结果表明,干扰组Wnt5a mRNA表达和蛋白表达水平较对照组显著降低(0.16±0.03 vs 1.03±0.02)(P<0.05),Wnt信号通路下游关键基因Axin2和β-catenin的表达量发生了显著下调(0.41±0.08 vs 1.03±0.05; 0.25±0.04 vs 1.03±0.05)(P<0.05);同时对干扰组转染Wnt5a过表达载体(PCDNA3.0-Wnt5a),结果发现干扰组Wnt5a的表达水平能够恢复(1.19±0.07 vs 1.03±0.02)。本研究成功构建了靶向鸡Wnt5a的shRNA慢病毒表达载体,可有效沉默Wnt5a基因在鸡DF-1细胞和胚胎干细胞中的表达,并且稳定表达Wnt5a-shRNA2的胚胎干细胞系可干扰Wnt信号转导,该结果将为进一步在细胞水平开展Wnt5a基因及其介导的Wnt信号通路的功能研究提供理论依据。

来源：2020年第2期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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