农业生物技术学报

作者：谷明娟, 高丽, 周新宇, 吴迪, 魏著英, 李光鹏, 白春玲

单位：内蒙古大学 省部共建草原家畜生殖调控与繁育国家重点实验室,呼和浩特 010070

关键词：蒙古牛,POLLED位点,无角牛,P202ID基因型,CRISPR/Cas9,

基金：国家转基因生物新品种培育科技重大专项(2016ZX08007-002); 内蒙古科技重大项目(KCBJ2018002)

在养殖业中,牛角作为个体间争斗和伤人工具而成为养牛业的隐患之一。POLLED位点是目前发现控制牛(Bovidae)无角性状的主要位点,但在实际生产中,存在该位点的牛并不多见。为研制无角基因编辑牛,本研究利用CRISPR/Cas9技术,将POLLED位点P202ID基因型定点整合到有角蒙古牛(Bos taurus)胎儿成纤维细胞基因组中,建立P202ID基因型蒙古牛成纤维细胞系。首先以牛POLLED位点为靶点,设计合成4对单导向RNA (single guide RNA, sgRNA),并插入到CRISPR/Cas9系统表达载体。Surveyor酶切结果显示,由sgRNA1~4构建的载体切割效率依次是24%、26%、55%和17%,其中pCas-Guide-EF1α-GFP-sgRNA3活性最高。利用电转染法将活性最高的切割载体与含有P202ID序列的打靶载体共转染到蒙古牛胎儿成纤维细胞,通过流式细胞仪分选阳性单细胞,进一步培养使其形成单克隆细胞;然后利用PCR及DNA测序技术,鉴定得到4株定点整合入细胞基因组的阳性单克隆细胞,可作为后续体细胞核移植的供体细胞。本研究可为培育无角体细胞克隆牛提供实验材料和技术支撑,为研究牛角的发生发育机制提供基础材料。

来源：2020年第2期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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