农业生物技术学报

作者：董文敏, 贺春萍, 吴伟怀, 梁艳琼, 谢立, 李锐, 黄兴, 郑金龙, 习金根, 陆英, 易克贤

单位：1 南京农业大学 植物保护学院,南京 210095; 2 中国热带农业科学院 环境与植物保护研究所/农业农村部 热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室,海口 571101; 3 海南大学 林学院,海口 570228

关键词：橡胶树褐根病,环介导等温扩增(LAMP),有害层孔菌,快速分子检测,

基金：国家重点研发计划项目(2018YFD0201100); 国家天然橡胶产业技术体系建设专项资金资助项目(CARS-33-BC1); 海南省科协青年科技英才创新计划项目(QCXM201714)

有害层孔菌(Phellinus noxius)引起的橡胶树(Hevea brasiliensis)褐根病是严重危害天然橡胶的一种根部病害。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术由于特异性强、灵敏度高、反应迅速、成本低等优势,已在植保等诸多领域得到广泛应用。为了建立一种能够快速、高效、准确地检测橡胶树褐根病菌的技术,本研究以SYBR GreenⅠ为指示剂,建立了橡胶树褐根病菌有害层孔菌的环介导等温扩增可视化快速检测方法。根据橡胶树褐根病菌特异的核糖体转录间隔区序列设计了4条引物(2条内引物FIP/BIP, 2条外引物F3/B3)进行LAMP扩增。对LAMP反应条件和体系进行优化,并进行特异性和灵敏度验证,最后进行田间疑似褐根病样本验证。研究确定了最佳反应体系(25 μL中模板100 ng/μL, 外引物F3/B3各0.2 μmol/L, 内引物FIP/BIP各1.2 μmol/L, dNTPs 1.4 mmol/L, Mg2+ 6 mmol/L, 甜菜碱0.8 mol/L, Bst DNA polymerase 8 U/μL)和反应条件(最佳反应温度63 ℃, 反应时间1 h)。特异性验证结果显示,橡胶树褐根病病菌LAMP产物均呈阳性(绿色),而其他病原菌组织LAMP产物均为阴性(橙色)。灵敏度检测结果显示,该体系的DNA最低检测限为1 pg/μL,比常规PCR灵敏度高1 000倍。20株田间疑似褐根样本应用LAMP体系检测,其病原检出率为85%,而常规PCR检出率为70%或75%。本研究建立的LAMP检测体系能有效用于橡胶褐根病疑似样本的快速检测,对及时科学的防控该病害具有重要意义。

来源：2020年第6期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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