农业生物技术学报

作者：王文文, 俞英, 张勤

单位：1 山东农业大学 动物科技学院,泰安 271018; 2 中国农业大学 动物科学技术学院 畜禽育种国家工程实验室/农业部畜禽遗传育种重点实验室,北京 100193

关键词：CRISPR/Cas9,猪,黏蛋白4 (MUC4)基因,溶质运载蛋白家族12成员8 (SLC12A8)基因,

基金：国家自然科学基金(31702093; 31572361); 中国博士后科学基金(2019M652449)

产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic Escherichia coli, ETEC) F4ac是引起新生仔猪(Sus scrofa)腹泻的一种主要病原菌。黏蛋白4 (mucin 4, MUC4)和溶质运载蛋白家族12成员8 (solute carrier family 12 member 8, SLC12A8)基因是影响仔猪对ETEC F4ac 易感性的候选基因,且这两个基因的物理位置位于数量性状基因座(quantitative trait locus, QTL)定位的F4ac受体基因区段内。本研究采用CRISPR/Cas9系统,分别构建了5个和6个MUC4及SLC12A8基因敲除载体。首先以猪MUC4和SLC12A8基因为靶点,分别设计合成5对和6对单导向RNA (single guide RNA, sgRNA),并插入到pX330质粒。将测序成功的载体对猪的小肠上皮细胞系IPEC-J2进行基因打靶,T7E1酶切实验证明MUC4和SLC12A8分别有3个和5个打靶载体具有基因敲除活性。其中MUC4的3个打靶载体的切割效率依次是8.4%、6.7%和6.2%,SLC12A8的5个打靶载体的切割效率依次是18.8%、19.1%、12.2%、18.1%和13.1%。利用Western blot进一步检测打靶后目的蛋白表达情况,结果表明pX330-MUC4-3、pX330-MUC4-4和pX330-MUC4-5打靶使目的蛋白表达有不同程度的降低,其中pX330-MUC4-4敲除效率最高。而SLC12A8的5个打靶载体中,pX330-SLC12A8-2、pX330-SLC12A8-5和pX330-SLC12A8-6打靶使目的蛋白表达有不同程度的降低,其中pX330-SLC12A8-5敲除效率最高。本研究为后续获得猪MUC4及SLC12A8基因缺失型细胞株提供实验材料和技术支撑,为进一步研究基因功能提供基础材料。

来源：2020年第7期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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