农业生物技术学报

作者：栾宏瑛, 陈爱娥, 王荟洁, 刘晶, 王洪洋, 李灿辉

单位：1 云南师范大学 云南省马铃薯生物学重点实验室,昆明 650500; 2 云南师范大学 云南省高校马铃薯生物学重点实验室, 昆明 650500; 3 云南师范大学教务处, 昆明 650500

关键词：核定位信号,融合基因,植物表达载体,亚细胞定位,效应蛋白,

基金：国家自然科学基金(31800134); 云南省应用基础研究计划面上项目(2019FB023)

植物细胞高度分隔成不同的膜亚细胞结构,在不同的地点适当地装配相关的蛋白来执行特定的细胞反应。细胞核是细胞的控制中心,以高度协调的方式进行蛋白质表达和运输。细胞核定位信号(nuclear localization signal, NLS)能够促进蛋白定位于细胞核中,对研究蛋白的细胞生物学功能有重要作用。基于目前NLS植物表达载体存在局限性,本研究用无缝克隆技术,将NLS与绿色荧光蛋白基因(green fluorescent protein gene, GFP)融合,插入植物双元表达载体pRI101-AN中,获得一个新的pRI101-NLS-GFP植物表达载体。利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导瞬时表达体系在本氏烟(Nicotiana benthamiana)中表达pRI101-NLS-GFP,以未融合NLS的pRI101-GFP为对照,荧光观察表明NLS-GFP融合蛋白主要聚集在细胞核,而pRI101-GFP荧光遍布整个细胞。同时利用马铃薯晚疫病致病疫霉菌(Phytophthora infestans)分泌的精氨酸-某氨基酸-亮氨酸-精氨酸(arginine-x-leucine-arginine, RXLR)效应蛋白PITG_04314 (PITG: Phytophthora infestans T30-4 gene, GenBank No. XM_002905913)进一步研究该载体是否将融合蛋白成功导入细胞核中。前期研究证明PITG_04314定位于细胞核,伴有细胞质的背景,而细胞核是其毒性功能的主要场所。为进一步证实PITG_04314的细胞定位,通过无缝克隆技术将PITG_04314融合到pRI101-NLS-GFP和pRI101-GFP中。发现与前期研究结果一致,GFP-PITG_04314定位于细胞核,伴有细胞质的背景,而NLS-GFP-PITG_04314聚集于细胞核中。瞬时超量表达GFP-PITG_04314和NLS-GFP-PITG_04314都能促进晚疫病的侵染,表明细胞核是PITG_04314发挥毒性的场所。研究结果表明,基于无缝克隆技术的NLS-GFP融合基因植物表达载体系统可以使目标蛋白定位于细胞核中。该载体有望在病原菌蛋白细胞生物学功能研究中得到广泛应用。

来源：2020年第7期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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