农业生物技术学报

作者：王雅欣, 杨晨茹, 赵宇杰, 孙晓晴, 李尚琪, 张研, 刘英杰, 李炯棠

单位：1 上海海洋大学 水产科学国家级实验教学示范中心,上海 201306; 2 中国水产科学研究院 生物技术研究中心/农业农村部水生动物基因组学重点实验室/北京市渔业生物技术重点实验室,北京 100141

关键词：长链脂肪酸延长酶5 (Elovl5),CRISPR/Cas9,基因敲入,鲤,高不饱和脂肪酸,

基金：国家自然科学基金(31672644); 国家重点研发计划(2018YFD0900102); 中国水产科学研究院级基本业务费(2018HY-ZD0207; 2018B004)

CRISPR/Cas9技术广泛应用于基因敲除,利用敲入包含荧光蛋白和目标基因的片段,有助于早期筛选实验动物。长链脂肪酸延长酶5 (elongation of very long chain fatty acids 5, Elovl5)是鱼类调控高不饱和脂肪酸合成的关键酶之一。为在斑马鱼(Danio rerio)研究鲤(Cyprinus carpio) Elovl5活性,本研究构建包含Tol2序列、斑马鱼短链肌球蛋白2基因(myosin light chain 2, Mylz2)启动子、红色荧光蛋白基因(red fluorescence gene, DsRed2)、斑马鱼Elovl5启动子、鲤Elovl5基因、2A剪切肽和绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP)的载体,扩增获得一段长7.5 kb的片段。利用CRISPR/Cas9方法,将此片段敲入斑马鱼基因组。敲入成功的斑马鱼在受精72 h后开始于肌肉显红色荧光。对利用红色荧光筛选敲入成功的斑马鱼,进一步用PCR扩增DsRed2予以确证。在存活斑马鱼中,基因敲入阳性率为28.7%。相比对照组,仅在实验组观察到鲤Elovl5表达。实验组的18碳不饱和脂肪酸含量下降18.6%,20碳和22碳不饱和脂肪酸含量提高31.8%,其中20:4n-3不饱和脂肪酸含量是对照组的2.4倍(P<0.05)。本研究采用CRISPR/Cas9技术,构建转鲤Elovl5斑马鱼,提高了斑马鱼高不饱和脂肪酸含量,为进一步研究鲤不饱和脂肪酸合成的遗传机制提供基础。

来源：2020年第7期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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