农业生物技术学报

作者：何海健, 刘正奎, 吴瑗, 王志鹏, 陈琳, 王磊, 周莹珊, 蒋春燕, 宋厚辉, 王晓杜

单位：1 金华职业技术学院 农业与生物工程学院,金华 321007;2. 浙江农林大学 动物科技学院·动物医学院,杭州 311300;

关键词：猪病毒性腹泻,多重连接探针扩增技术 (MLPA),毛细管电泳,灵敏度,

每年冬春季爆发于规模化养猪场的腹泻常由不同病毒引起,临床表现为相似腹泻症状。为了区分临床腹泻样本中的病毒性病原体,迫切需求建立一种快速同时检测常见6种病毒性腹泻疾病的病原技术。本研究针对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)S基因、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)N基因、猪Delta冠状病毒(Porcine delta coronavirus, PDCoV)N基因、猪博卡病毒(Porcine bocavirus, pBCaV)NS1基因、猪诺如病毒(Porcine norovirus, pNoV)RdRp基因、猪轮状病毒(Porcine rotavirus, pRV)NSP1基因的核酸保守区域, 设计多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification, MLPA)探针和预扩增引物,利用MLPA技术和毛细管电泳技术,建立检测6种疾病病原核酸的检测方法。结果表明,单一探针检测混合模板,显示出高度特异性;混合探针总浓度在1.33 nmol/L时,各种疾病扩增条带具有特异性且与预期大小一致,pBCaV、pNoV、PDCoV、PEDV、 pRV 、TGEV分别约为102、110、117、124 、131、138 bp。本方法与其他临床疾病如猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV)、猪瘟病毒(Classic swine fever virus , CSFV)、伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)和猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2 , PCV2)没有交叉反应,特异性佳。pBCaV、pNoV、PDCoV、PEDV、 pRV 、TGEV检测最低极限值分别为：7.58×101、7.56×100、7.54×100、7.53×100、7.50×101和7.49×100 copies/µL。组间和组内重复性好,利用本方法检测临床收集和模拟样本67份,PEDV与病毒分离方法100%符合,pRV 、TGEV、pBCaV、pNoV、PDCoV与病毒模拟样本符合率达到100%。本研究为临床提供一种新型的可同时检测6种腹泻病原的技术,为临床疾病防控快速反应提供技术支持。

来源：2020年第9期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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