农业生物技术学报

作者：马肖, 赵世浩, 王峰, 贺文, 陈金湘, 张秋平, 周仲华

单位：湖南农业大学 农学院,长沙 410128

关键词：苏云金芽胞杆菌(Bt),Cry5Aa基因,原核表达,蛋白纯化,表达鉴定,

单一转苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)基因Cry1Ab/Cry1Ac抗虫棉(Gossypium)作为我国生产上大面积种植作物,随着种植时间及面积的增加导致害虫对Bt毒蛋白的抗性增强迫使新型Bt基因研究工作成为解决问题的关键。Cry5Aa是一种具有兼抗鳞翅目和线虫的新型Bt杀虫基因,由湖南农业大学棉花研究所成功转入棉花,并获得稳定遗传的'JX0010'、'JX0020'品系,本研究构建了Cry5Aa全长基因原核表达载体,优化了原核表达诱导条件,并且对其在转Bt-Cry5Aa基因棉花品系中的表达进行了鉴定。结果表明,在37 ℃ 220 r/min 1.0 mmol/L异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG)条件下诱导4 h,其蛋白表达量最高。通过Western blot分析,发现蛋白分子量为79 kD,与理论值一致;同时,该蛋白以包涵体形式存在,通过谷胱甘肽-Sepharose4B小颗粒亲和层析纯化,蛋白纯度可达95%以上;转Bt-Cry5Aa基因棉花品系的鉴定实验表明：Cry5Aa基因能在转基因品系'JX0010'、'JX0020'中表达杀虫毒蛋白,且'JX0010'的Cry5Aa毒蛋白表达量在棉花不同时期及不同部位均高于'JX0020',且在生长期以蕾期为最高表达,植株部位上以叶片为最高表达。本研究构建了Bt-Cry5Aa杀虫基因的原核表达载体,获得了Cry5Aa的纯化蛋白,初步对其在棉花中的表达进行了鉴定,为对Bt-Cry5Aa杀虫基因的抗虫性、安全性等转基因检测及进一步在棉花中的应用提供了理论基础。

来源：2020年第9期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

查看农业生物技术学报杂志2020年第9期