农业生物技术学报

作者：沈肖玲, 易建平, 王荣洲, 钱俊婷, 李艳敏, 姚海峰, 楼兵干

单位：1 浙江大学 生物技术研究所,杭州310058; 2 农业部作物病虫分子生物学重点实验室; 3 上海出入境检验检疫局,上海 200135; 4 浙江省植物保护检疫局,杭州310020; 5 杭州市临安区农业技术推广中心,临安 311300

关键词：达旦提狄克氏菌,鞭毛蛋白基因(fliC),TaqMan探针,qRT-PCR,

基金：浙江省“三农六方”农业科技协作项目(No. CTZB-F160728AWZ-SNY1-3)和杭州市重点科技发展计划项目(No. 20172015A09)

达旦提狄克氏菌(Dickeya dadantii)引起的甘薯(Ipomoea batatas)茎腐病是严重危害甘薯的一种病害。目前该病在浙江、河北、河南等省均有发生。带菌种薯和种苗的远距离调运是病害向无病区传播的主要途径,因此准确、灵敏、快速的检测方法是严格执行检疫措施的有力工具。将D. dadantii编码鞭毛蛋白基因(flagellin protein gene, fliC)序列与近缘种比对发现,该基因特异性强,适合作为分子检测的靶标。本研究以fliC基因为靶标,设计了特异性引物和TaqMan探针,建立了D. dadantii荧光定量PCR (TaqMan qRT-PCR)检测方法。结果发现,该方法对D. dadantii显示了良好的特异性,能使其与同属不同种及不同属细菌有效区分。同时研究表明,该方法具有较高的灵敏度,对菌体DNA的检测灵敏度可达280 fg/μL,是常规PCR的1 000倍;对菌液的检测灵敏度可达2 CFU/μL (CFU: 菌落形成单位, colony forming units),比常规PCR检测方法高100倍。利用NGM (nematode growth medium)培养基对疑似甘薯茎腐病样本进行分离,发现D. dadantii能够在培养基上形成深褐色至蓝色的菌落,可明显提高病原菌分离纯化的效率。采用构建的TaqMan qRT-PCR方法、常规PCR法和基于NGM培养基的分离培养法对70份甘薯和土壤样品进行实际样本的检测;结果表明,TaqMan qRT-PCR法、常规PCR法和分离培养法的阳性检出率分别为91.4%、77.1%和71.4%,TaqMan qRT-PCR检测准确性更高,且将检测时间从96 h缩短为1.5 h。本研究建立的基于TaqMan探针的荧光定量PCR检测体系能有效用于甘薯茎腐病疑似样本的快速检测,对该病害的检疫具有重要的意义。

来源：2019年第3期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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