农业生物技术学报

作者：何海健, 吴瑗, 刘正奎, 王志鹏, 陈琳, 王磊, 宋厚辉, 王晓杜

单位：1 金华职业技术学院 农业与生物工程学院,金华 321007;2 浙江农林大学 动物科技学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程实验室,杭州,311300

关键词：猪流行性腹泻病毒(PEDV),TaqMan探针,qRT-PCR,基因型,

基金：浙江省自然科学基金(No. LY16C180001)、金华市重点研发计划农业类项目(No. 2016-2-013和No. 2018-2-004)和浙江省科技重点研发计划项目(No. 2018C02028)

猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)是目前导致猪(Sus scrofa domestica)群严重腹泻的主要病原体之一,临床中危害最严重的是PEDV变异毒株(GⅡ型)。建立快速准确的诊断方法可鉴别临床上PEDV的基因型,有利于开展不同基因型的PEDV防控。本研究针对PEDV的纤突蛋白(spike, S)基因N端的相对保守区设计1对引物,同时针对变异毒株(GⅡ型)和经典毒株(GⅠ型)的差异区域设计2个探针,探针采用5-羧基荧光素(5-carboxyfluorescein, FAM)(GⅡ型)和5-六氯荧光素氨基磷酸酯(5-hexachloro-fluorescein hosphoramidite, HEX)(GⅠ型)荧光信号分别标记,通过扩增条件摸索、特异性、敏感性、重复性等实验,建立一种基于探针的一步法双重qRT-PCR检测技术,用于鉴别猪流行性腹泻病毒的不同基因型。结果显示：本研究建立了该方法的标准曲线,该方法在10-1~108拷贝数/μL范围内,检测GⅡ毒株(R2=0.9892)和GⅠ型毒株(R2=0.9914)具有较好的扩增效率,Ct值与浓度之间具有较好线性关系;检测灵敏度分别为GⅡ毒株7.34拷贝数/μL和2.3×102半数组织培养感染剂量(tissue culture infective dose, TCID50)/0.1 mL、GⅠ型毒株4.32拷贝数/μL和4.3×103 TCID50/0.1 mL;GⅠ型和GⅡ型之间没有交叉反应,且与猪δ冠状病毒(Porcine deltacoronavirus, PDCoV)、猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)、猪瘟病毒(Classic swine fever virus, CSFV)、猪轮状病毒(Porcine rotavirus, RV)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus, JEV)及猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)等病毒核酸之间没有交叉反应,特异性较好;组间和组内变异系数低,重复性好;临床样品检测结果与病毒分离方法符合率为100%。本研究为临床疑似PEDV感染病料的检测提供快速准确的鉴别方法,并可确定其基因型,为防控该病提供技术支持。

来源：2019年第7期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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