农业生物技术学报

作者：包世俊, 丁小琴, 邢小勇, 薛慧文, 伏小平, 武小椿, 温峰琴

单位：甘肃农业大学 动物医学院,兰州 730070

关键词：滑液支原体(MS),丙酮酸脱氢酶,共表达,

基金：国家自然科学基金(No. 31360620)和甘肃省自然科学基金(No. 1308RJZA235)

滑液支原体(Mycoplasma synoviae, MS)是禽类重要的致病性支原体,MS感染可引起鸡(Gallus gallus)和火鸡(Meleagris gallopavo)的呼吸道病症以及关节炎和关节滑膜炎,导致蛋鸡产蛋量及鸡蛋品质下降、种蛋孵化率降低、肉鸡生长发育迟缓、饲料转化率低、胴体废弃率高等,给养鸡业造成重大经济损失。对滑液支原体的快速检测方法及良好免疫制剂的研究,可为其感染的快速诊断和有效预防提供支持。基于此,本研究参照GenBank中MS WVU1853株(GenBank No. CP011096.1)丙酮酸脱氢酶E1 α亚基基因(pyruvate dehydrogenase E1 α subunit gene, pdhA)和β亚基基因(pdhB)序列及结构设计引物,应用PCR技术分别扩增获得二者及其以单碱基重叠方式连接的自然序列AB,采用overlap-PCR技术完成基因优化,将pdhA与pdhB以及AB分别克隆入原核表达载体pETduet-1和pET-28a(+),成功构建原核共表达质粒pETDuet-AB和pET-AB;并在分别转化大肠杆菌(Escherichia coli) BL21 (DE3)后经异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-thiogalactoside, IPTG)诱导表达,表达产物纯化后应用SDS-PAGE分析,进而检测其酶促活性。SDS-PAGE结果表明,MS WVU1853株pdhA和pdhB基因在两种质粒转化的大肠杆菌中均获表达,且表达产物相对分子量分别为43和36 kD,但pET-AB转化菌中两种蛋白均高效表达,而pETDuet-AB转化菌中α亚基表达效率明显较低;酶活性检测结果表明,两种转化菌诱导表达产物均具有酶促活性。本研究基于单核苷酸重叠构建了MSpdhA和pdhB基因的共表达载体并在大肠杆菌中获得高效表达,为pdhA和pdhB生物学功能的研究提供了良好的材料,为MS诊断方法的建立提供了可能的标识物,也为MS感染相关免疫制剂的研发提供了可能的疫苗候选,为两个基因的共表达提供了新的思路。

来源：2019年第9期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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