农业生物技术学报

作者：靳伟, 代敏敏, 李德娟, 樊宝良

单位：河北农业大学 动物科技学院,保定 071000

关键词：CRISPR/Cas9,腮腺分泌蛋白基因(PSP),体外转录,脱靶效应,

基金：国家转基因生物新品种培育科技重大专项(No. 2014ZX08006-005)、国家自然科学基金(No. 30972081)、河北省科技支撑计划项目(No. 14236602D-4(2014))和河北省现代农业产业技术体系蛋肉鸡产业创新团队遗传资源开发与利用岗位项目(No. HBCT2018150201)

唾液腺生物反应器作为一种新型生物反应器,是利用唾液分泌蛋白的调控区特异性表达各种外源蛋白,常用的唾液分泌蛋白为腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein, PSP)。本研究旨在建立利用CRISPR/Cas9系统对猪(Sus scrofa) PSP基因定点整合的方法体系,并分析CRISPR/Cas9对PSP基因整合的脱靶效应,筛选获得能够实现上述目标的有效的基于CRISPR/Cas9系统的sgRNA。实验首先根据PSP基因序列在线设计单链引导RNA (single guiding RNA, sgRNA),选出5条sgRNA序列;然后利用sgRNA体外转录试剂盒和Cas9体外酶切试剂盒,筛选出靶向PSP基因体外酶切活性较高的sgRNA序列,构建sgRNA和Cas9共表达载体pCas9-sgRNA,同时构建携带新霉素抗性基因(neomycin resistance gene, NeoR)表达结构的打靶载体pMD19-5'arm-NeoR-3'arm;最后将sgRNA和Cas9共表达载体和打靶载体共转染猪肾细胞(PK-15细胞),利用新霉素进行筛选,分离单细胞克隆。通过PCR及测序鉴定NeoR定点敲入阳性单克隆细胞并进行脱靶效应分析。体外酶切结果表明,sgRNA1、sgRNA3、sgRNA4和sgRNA5均有较高的体外酶切活性;测序结果显示,4个sgRNA均成功针对猪PSP基因实现了定点敲入,sgRNA1、sgRNA5敲入效率分别为22.7% (5/22)和26.1% (6/23),且均存在1个潜在脱靶位点发生了脱靶效应;sgRNA3、sgRNA4敲入效率分别为50.0% (12/24)和42.1% (8/19),5个潜在脱靶位点均未发生脱靶效应。本研究成功建立了针对猪PSP基因进行基因编辑的方法体系,筛选出高效引导外源基因定点敲入猪PSP基因的sgRNA,为深入研究转基因猪提供了基础资料。

来源：2019年第9期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

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