农业生物技术学报

作者：张文静, 陈海超, 郭利建, 刘香利, 赵惠贤

单位：1 西北农林科技大学 生命科学学院,杨陵 712100; 2 西北农林科技大学 旱区作物逆境生物学国家重点实验室,杨凌 712100

关键词：小麦,TaWTG1,原核表达,纯化,去泛素化酶活性,

基金：杨凌示范区产学研用协同创新重大项目计划(No. 2017CXY-01)和国家自然科学基金(No. 31471482和No. 31701419)

去泛素化酶是泛素化途径的逆调节酶,参与调控蛋白质的降解。为了探索小麦(Triticum aestivum)去泛素化酶家族成员WTG1 (wide and thick grain 1)基因的功能,本研究利用生物信息学方法对小麦TaWTG1编码蛋白的理化性质和结构进行了分析;进一步构建其原核表达载体pET28a-TaWTG1,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)表达菌株BL21(DE3),对重组蛋白His-TaWTG1诱导表达条件(包括培养温度, 异丙基硫代半乳糖苷(isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside, IPTG)浓度和诱导时间)进行优化;进一步对重组蛋白进行可溶性分析和镍柱分离纯化,并对其去泛素化活性进行体外验证。结果表明,TaWTG1蛋白由319个氨基酸组成,理论分子量为35.38 kD,等电点为4.62;其三级结构主要由α螺旋构成,含有OTU (ovarian tumor-related proteases)相关蛋白酶家族的otubain保守结构域;重组蛋白His-TaWTG1的最佳诱导表达条件为0.4 mmol/L IPTG、28 ℃诱导6 h;该重组蛋白主要以可溶形式存在于上清液中。Western blot分析确定用镍柱分离纯化获得的重组蛋白为目的蛋白;体外活性分析实验表明,TaWTG1具有去泛素化酶活性,可以切割赖氨酸(K)48和K63连接的四聚泛素链。本研究为TaWTG1基因功能研究提供了基础资料。

来源：2019年第10期

《农业生物技术学报》期刊编辑部

查看农业生物技术学报杂志2019年第10期